同位素标记的蛋白质光谱

生物分子核磁共振光谱学的spin-1/2。核磁共振的利用天然丰度的99.98%但患有信号重叠蛋白质比∼50残留的大量生物分子的质子和质子共振范围相对狭窄。多维光谱相关质子与蛋白质和碳氮可以减少信号的数量,提高分辨率,但受限于NMR-active碳和氮同位素的自然丰度较低(1.1%)13C和0.366%15N)。更大的蛋白质可以使氘化以减少不利的偶极相互作用和自旋扩散不利。例如,结合2H -13C -15N同位素标记的蛋白质与横向弛豫优化光谱(TROSY),一个核磁共振实验,减少了有效的横向弛豫,从而减少线宽,增加敏感度的信号从大分子长时间相关性,更大的蛋白质以及复合物通常100 kDa摩尔质量可以通过核磁共振研究。在某些情况下,使用含重氢结合甲基标签,蛋白质的组装1 MDa已经成功地研究了核磁共振。替代NMR-active原子核发生天然丰度100%,等19F,正看到越来越使用核磁共振应用程序(如。在筛选方法),由于其灵敏度和宽敞的光谱。然而,他们很少出现在天然的蛋白质,我们不讨论整合19在更多的细节。

小角散射(SAS)和振动光谱也依赖于同位素浓缩大分子的推断出特定区域的信息。SAS方法利用溶剂对比变化perdeuterated蛋白质利用缓冲区补充与特定的D2O: H2O比率。由此产生的散射长度密度差异溶剂和生物分子允许各个呈现(复杂的)部分和其结构描述。红外和拉曼光谱,更换特定保税与同位素原子允许转让的乐队,否则特定债券在高度复杂的光谱。的振动模式的分配特定的化工集团或氨基酸残基丰富13C或15N可以生成有价值的空间维度的蛋白质红外光谱。同样,同位素浓缩使振动频率在拉曼光谱分配给特定的残留物,因此有助于确定蛋白质的二级结构或折叠状态。

为了丰富感兴趣的蛋白质的同位素,几种方法基于表达系统提供合适的资源开发所需的前体分子,产生不同的蛋白质只有在其同位素组成(isotopologues)。通常情况下,同位素标记的蛋白质是通过重组生产系统,通常在一个合适的表达式大肠杆菌,而且酵母、昆虫和哺乳动物细胞。重组生产有毒或膜蛋白,细胞游离表达式可以使用。有很多实验变化取决于蛋白质表达系统和目标,但通常最小的媒体在细菌中得到表达13比较和/或15NH4Cl作为唯一的碳和氮源的稳定碳、氮同位素。另一种是研究人glycerol-based autoinduction媒体。在统一的标签计划,几乎所有原子中的特定元素的蛋白质(12C,14与各自的同位素(N)所取代13C,15N),通常导致超过90%的同位素浓缩在目标蛋白。含重氢(通常是更大的蛋白质> 25 kDa)可以通过用D代替水2O和另外的媒体补充表达细胞增长2H -13C-labelled葡萄糖。然而,含重氢仅适用于原核细胞(大肠杆菌和p . Pastoris),真核生物遭受有毒的同位素效应。作为一种替代方法,可以使用氘氨基酸玉米胚芽蛋白酶解物结合无细胞表达系统。无细胞表达系统尤其适用于氨基酸选择性标签,标签的特定的甲基,和stereo-array同位素标签(航行)。然而,在核磁共振光谱信号重叠的大型蛋白质仍然可以证明具有挑战性。同样,红外光谱和拉曼光谱的解释以及SAS数据是复杂的信号带来大的蛋白质。

图1 同位素标记蛋白质转译后的修改策略。(a)统一的同位素标记的靶蛋白没有或所有质子,碳和/或铵离子所取代2H,13C或15N(红色所示)。(b) Residue-specific同位素标记的特定氨基酸残基(如。亮氨酸、酪氨酸)取而代之的是同位素示踪同行会面,而其他残留物仍未标记的。(c)特定站点标签的一个或多个同位素标记的氨基酸残基在某些关键位置(s)在一个未标记的多肽链。(d)阶段同位素标签使isotope-labelled蛋白质片段(肽)的合并成一个更大的蛋白质。|白介素是用来说明不同的标签计划。天然同位素丰度蛋白部分显示在灰色和isotope-enriched残留物/部分用红色。

标签的单氨基酸残基是一个潜在的战略聚焦于一个或少数几个关键职位在一个蛋白质。这个策略允许非常简化的信号分配和容易监测反应涉及标签键残留(s),但是有忽略的缺点更大的蛋白质上下文。在这种方法中,isotope-labelled自然或非自然氨基酸介绍了网站在所需的位置由蛋白质(半)合成或遗传密码的扩张。

阶段性同位素标签是一个策略,减少光谱的复杂性,应用于小型和大型蛋白。这个标签策略成为可能的表达蛋白质结扎(EPL)和蛋白质反式拼接(PTS),以及通过使用enzyme-mediated结扎的方法。标记和未标记的片段的蛋白质分别产生的利益,有不同的residue-specific标签模式,并随后化学或chemoenzymatically绑定。

EPL半合成的蛋白质

isotopologues整合到一个或多个蛋白质片段,或在选定的位置在一个蛋白质,需要连接两个(或更多)不同的多肽,理想情况下,一个本地酰胺键,这样蛋白质结构依然没有改变。本机化学结扎是1994年由道森开发的et al。链接不受保护的肽段的水条件和提供了一个途径访问许多修改的蛋白质。替代amide-forming结扎包括KAHA和对丝氨酸/苏氨酸结扎; 然而,相对很少有蛋白质准备使用这些策略。 所示,NCL反应需要一个c端硫酯功能在一个肽段。另一个肽段氨基半胱氨酸残基。结扎后,本机酰胺键形成结扎部位。NCL扩展现有的工具箱允许快速和高效的合成蛋白质,和我们直接的读者最近评论这些主题。

图2 化学蛋白质合成基于本地化学结(NCL)的同位素标签。所有的肽段是由固相多肽合成(许可证)。(一)一般NCL的反应机理。(b)特定站点四个残留的氮同位素标签(红色)的Vpu (2 - 81)。引发的合成(34 - 72)糖肽库不同Phe65与10个不同(红色)15NCL N-labelled氨基酸。特定场地同位素标签不同残留在预测核心UDP-glucose:糖蛋白葡糖基转移酶(UGGT)识别网站(Phe65)证实了至关重要的作用的疏水残基通过核磁共振光谱学(PDB:3 il8)。| |灰色:未标记的蛋白质部分红色:N isotope-labelled氨基酸残基。

固相肽合成的精度高、范围(许可证)结合NCL使特定站点介绍广泛的修改(包括铝),非天然的氨基酸,标签和isotope-enriched氨基酸。在一个早期的例子,Kochendoerferet al。证明特定站点整合isotope-enriched 81 -残留病毒蛋白质氨基酸U (Vpu)通过化学合成和NCL 。这个积分膜蛋白是病毒粒子释放后人类免疫缺陷的关键virus-1 (hiv - 1)感染通过其调制的贩卖病毒蛋白和膜透性。Kochendoerferet al。生成一个15N-labelled Vpu(2 - 81)模拟的病毒蛋白通过切断两个网站标记肽段在一起。第一部分Vpu(2-39)15N-enriched变体(isotopologues) Leu11 Ala18,第二段Vpu(40 - 81)包含这些isotopologues Ala49 Leu66。NCL并调整到胶束和脂质影响后,Kochendoerferet al。评估网站的整体拓扑结构和渠道活动合成Vpu贴上标签。1H -15N HSQC(异核单量子相干性)和固态核磁共振(ssNMR)实验显示可比性特征之间的化学合成版本和重组表达,统一标签控制蛋白质(没有特定站点标签)。15N-labelling四个具体的残留蛋白质骨架的网站允许非常简化的信号分配统一标签相比Vpu变体。站点特定的标签模式提供了一个快速指纹Vpu ssNMR测量,只有四个15N-labelled残留物可被检测到。虽然缺乏,Vpu的一个例子是特定站点整合NMR-active核可用于报告关键职位在蛋白质结构和功能,特别是在膜ssNMR研究的系统。

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